RIKEN DNA Bank <电子邮件新闻> 第60号（中文版第1号）
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目录：
■ 两套新的“克隆系列”开始提供
■ 请反馈您的研究成果
■ DNA银行杂记（连载，省略）
■ DNA银行点滴（实验技术介绍等）
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■■■ 2套新的“克隆系列”开始提供■■■
http://www.brc.riken.jp/inf/distribute/kakaku.shtml#dna
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■■■请反馈您的研究成果■■■
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Gene Engineerign Division，RIKEN BioResource Center
3-1-1 Koyadai, Tsukuba Science City, Ibaraki, 305-0074 Japan
fax: +81-29-836-9120 e-mail: dnabank@brc.riken.jp
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■■■ 银行杂记■■■
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（日文连载，在此省略）
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■■■ DNA银行漫谈 ■■■
如何提高Genomic PCR实验的成功率？
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虽说市贩PCR试剂的扩增效率较以前大有提高，但做PCR而不见有相应条带的情况还是常有碰到。如果使用的DNA模板是基因组DNA，需要扩增的领域较长，特别是含有高GC含量的序列时，PCR条件设定会变得更加困难。最近，我们有较多机会从事Genomic PCR实验,从中得出了几点体会，在此予以介绍。
关于DNA模板的条件:
从生物个体组织或培养细胞提取基因组DNA的方法有许多，采用何种protcol到无须特别讲究。因为不需要像Southern blotting那样，须保持数十kb的的DNA片断长度。
简单地说，用组织溶解缓冲液（cell lysis buffe：50mM Tris-HCl，pH7.5, 10mM EDTA, 200mM NaCl, 1%SDS, Proteinase K 0.2-1mg/ml, 55℃, 2hr以上）将组织溶解，实施石炭酸-氯仿抽出和乙醇沉淀各一次，沉淀物溶于dH2O或TE buffer即可，精制程度不需很高。当然用市贩的Gemnome DNA 专用column精制，DNA质量可能更有保障。
所谓DNA的质量，用作PCR模板时主要是指纯度，DNA片断长度通常不需刻意留意。经过DNA提取过程中的vortex, pipetting操作，会使基因组DNA适度切断，而这往往能增加PCR反应的效率。如果扩增对象是数百bp的短链，用数十秒〜数分钟的超声波处理使基因组DNA断片化，效果会更好。
RNA的大量混入可能成为阻碍PCR反应的一大原因。不过，DNA抽出的最初阶段如在组织溶解缓冲液中添加了RNase A，这一问题将不易出现。其实，提取基因组DNA的操作适当“马虎”一点，譬如组织溶解过程的温度及时间管理不甚严密，让组织自身含有的RNase起作用，即使不外加RNase A也能达到消除RNA的效果（注意，DNA被DNase分解的危险性也高。）。
PCR反应液配制的最重要留意点是不可过多地加入DNA模板，20ul的反应系中含有5〜10ng就足够了。加入30ng以上的基因组DNA往往反而会阻碍反应进展。如果实验时没有扩增出PCR产物，首先应该考虑减少DNA模板而不应胡乱增加。当然，通过电泳确认分光光度计测得的DNA模板浓度是否准确，也应在考虑之列。
GC-rich领域的扩增:
如扩增序列中含有GC-rich领域，互补锁容易粘合而致DNA合成酶无法行驶。在伸张反应过程如何保持DNA互补锁的离解状态就成为了焦点。为此，设计高Tm值的引物是最基本的条件，最好在65℃以上。即使是不含GC-rich领域的PCR，也以使用较高Tm值的引物为佳。
使用Tm值为65℃的“引物对”时，最初尝试在60℃或65℃实施annealing。在很多场合提高annealing温度不仅能消除非特异条带，也同时增强特异产物的信号强度。此外，省略annealing步骤而采用2阶段PCR程序也是可供选择的方案。
为降低GC-rich领域的Tm值，往反应液中添加5〜10％的DMSO也是有效措施之一。此外，将变性阶段（denature step）的温度提高2〜3℃（97〜98℃）也是解决GC-rich领域扩增难的可取办法。为防止DNA合成酶过早失活，denature的时间不可太长。在我们实验室里，常采用20ul反应系，10秒变性时间的条件，结果良好。不过具体当依PCR仪的机种而定。
长DNA领域的扩增:
如需要扩增较长DNA领域,通常要求使用“Long PCR kit"。此类产品PCR扩增效率和酶的热稳定性都较好，扩增10kb以上的目标时特别有使用的必要。
不过，“Long PCR kit"这类产品的价格不菲，从经济角度考虑不妨先以普通PCR试剂一试。最近，通常的PCR酶制品也已能适用于6kb以上的DNA扩增,请仔细查阅厂家的最新版PCR试剂目录。
不局限于Long PCR，PCR反应后的电泳图像上只见不成带的smear产物的情况常会遇到。如果通过改变annealing温度仍不能解决问题，可将first-PCR后的反应液稀释50～100倍，取1ul加入2次反应液中，实施所谓的nested-PCR，很多场合会有期待值之上的效果。并且nested-PCR可以使用first-PCR的同一“引物对”，并不一定要在其内侧重新合成。
还有一个「小巧门」是,PCR试剂A的DNA合成酶与PCR试剂B的缓冲液配合使用，有可能获得优于原装匹配的结果，不仿一试。
（以上诸点仅供参考，不保证完全有效。作者：J. Pan）
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注：
1. 本电子邮件新闻不定期发行,约每月一次。
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发行人
日本理化学研究所・生物资源中心
基因材料开发室
dnabank@brc.riken.jp
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2007.04.18